PRÁCTICAS DE BACTERIOLOGIA PARA BACHILLERATO

PRÁCTICA No.1

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

Los medios de cultivo usados en Bacteriología contienen los nutrientes y factores físicos y químicos (pH, concentración de iones), necesarios para la reproducción bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los medios líquidos permiten la proliferación bacteriana por todo el medio, son de fácil manejo. Los medios sólidos permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias (colonias) cuyas características macroscópicas sirven de guía para la identificación de ciertas bacterias.

COMPETENCIA.

Preparar adecuadamente, medios de cultivos líquidos y sólidos, a partir de medios

deshidratados, siguiendo las instrucciones correspondientes.

MATERIAL.

Caldo tripticasa soya o caldo tioglicolato

Agar tripticasa soya deshidratado
Soporte con maya metálica
Frascos Erlenmeyer o balones volumétricos con apon de algodón o gasa
Cajas de petri
Bajalenguas de madera
Balanza
Agua destilada
Probetas tubos de ensayo

Olla de presiona

Mecheros

PROCEDIMIENTO.

MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO

1.se pesa el CTS sobre una balanza granataria (calibrada previamente). Se

observan las especificaciones en el frasco.

2.el CTS debe ser pesado sobre un papel especial para que no haga contacto con la superficie de la balanza.

3.colocar 50 ml de agua destilada en un erlenmeyer (el volumen se mide en una

probeta).

4.agregar el medio deshidratado. Disolver por agitación y calentamiento hasta que empiece a hervir. Luego esterilizar en la olla de presión ( 15 lbs de presión por dos horas).

5.después de esterilizar se procede a colocar el medio de cultivo sobre cada tubo de ensayo (esterilizados previamente) quedando así listo el medio de cultivo. Los medios líquidos deben mantenerse debidamente enroscados o sellados para evitar la contaminación.

PRACTICA No. 2

OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO

Un paso fundamental para el diagnostico bacteriológico es el aislamiento de bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza variada (pruebas bioquímicas, coloraciones, serología, etc.) se procede a su identificación.

Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las técnicas para obtención

de cultivos puros a partir de una flora mixta.

OBJETIVOS

1-Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Gram positivas y Gram negativas, a partir de una muestra con flora mixta.

2-Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los resultados que obtenga en esos medios.

3-Que constate por observación macroscópica y microscópica si obtuvo cultivo puro.

PARTE I.

MATERIAL POR LADO DE MESA.

-Una suspensión de heces 1:1000

-Una placa de Agar de tripticasa soya
-Una placa de Agar Mac Conkey
-Una placa de Agar sangre.

PROCEDIMIENTO

Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la

suspensión de heces utilizando el método de estrías para extenderlo.

Incubar todas las placas a 36ºC +/- 1ºC, hasta la siguiente practica de laboratorio

PARTE II

MATERIAL

Colorante para Gram y dos placas de agar  tripticasa soya.

PROCEDIMIENTO

1-Observar el número y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.

2-Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey y agar sangre, colorearlos por el método de Gram. Observarlos en el microscopio  y  anotar los resultados.

3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por bacterias Gram positivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya, incubarla a 36ºC hasta el próximo laboratorio. Hacer lo mismo con una colonia Gram negativa.

PARTE III

PROCEDIMIENTO

1-De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo cultivos puros.

2- Discusión

a) Método de estrías (fundamento y objetivo)

b) Análisis de cada medio de cultivo: nombre, función, clasificación, composición (sustratos, nutrientes e inhibidores)

c) Descripción de colonias.

D )Análisis de los resultados.

Frotis Bacteriano.

1. Se observa Morfología

2.Se observa tinción( Gram, Acido resistencia)

PRACTICA No. 3
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

PROPOSITOS

La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibióticos es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente.

Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base científica proporcionada por el laboratorio y así poder dar un buen tratamiento.

Básicamente hay dos técnicas para verificar estas pruebas: dilución en tubo y difusión en agar. La técnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y fines de la práctica diaria en el laboratorio. Además las pruebas de susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la elección de los agentes antimicrobianos más apropiados para el tratamiento de las enfermedades infecciosas.

OBJETIVOS

1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los antimicrobianos por el método de difusión en agar (método de KIRBYBAUER).

Habilidad    2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles.

3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al método e indicar la forma

de evitarlas.

Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son

inhibidos por concentraciones de antibióticos obtenidos con un régimen usual de dosificación.

Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran  concentraciones de antibióticos superiores a las que pueden obtenerse en la

sangre por medio de un régimen usual de dosificación.

Intermedio: Hoy en día se considera como prueba errática, que por lo tanto

debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana

resistente.

PROCEDIMENTO

Por medio de la técnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan alpie de la letra las instrucciones.

Es una técnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentración del inoculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta técnica solo sirve para efectuar el antibiograma a las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento rápido:

1. Staphylococcus aureus

2. Enterobacterias

3. Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria sp, debe hacerse en

Mueller-Hinton con 5% de sangre “achocolatado”.

Para prepara el agar de Mueller-Hinton debe seguir las siguientes indicaciones:

1.    Las cajas de petri deben tener un tamaño estándar (100 mm de diámetro)deben llenarse con aproximadamente 25 mL de agar líquido ya autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4mm de grueso.

2. Deben guardarse en refrigeración dentro de bolsas plásticas selladas (de 2 a

2.    8°C) por no más de 7 días.

3.    3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4.

4.    4.De cada lote de medio, incubar de 2 – 5 cajas por 24 horas a 36°C para comprobar su esterilidad.

ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBIÓTICOS:

Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no pierdan su potencial:

1.Congelar (idealmente a –20°C) los discos de Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina y Cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los discos que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos 2 horas antes de usarlos.

2.Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigerados sin congelación. De preferencia con un desecante

PROCEDIMIENTO:

1. Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual morfología del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro.

2.Inocular un tubo con 4 mL de caldo tripticasa soya o caldo infusión de cerebro - corazón.

3.Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36°C, hasta que aparezca una ligera turbidez.

4.Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estándar de Macfarland 0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar, agregar más caldo o solución salina estéril.

5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir un hisopo estéril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionándolo ligeramente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.

6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido.

7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no más de 15 minutos, con la tapadera cerrada.

8.Con pinzas estériles, colocar los discos impregnados de antibióticos amanera que queden lo más separado entre sí. Escoger los antibióticos acolocar dependiendo de la bacteria aislada.

9.Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp)

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

1. Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las cajas

ya con crecimiento.

2. Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa con una

regla por detrás de la caja petrí.

3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual

no debe tomarse en cuenta.

4.-Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en

milímetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.

PRACTICA No. 4

COPROCULTIVO

La infecciones éntericas pueden ser causadas por varios microorganismos, siendo de mayor importancia las bacterias del genero Shigella, Salmonella y desde 1991 el Vibrio cholerae O1

PROPÓSITO:

Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.

OBJETIVOS

1- Observar y describir la morfología de las Enterobacterias aisladas de la

muestra de heces

2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias

entéricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.

3-Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioquímica de las

bacterias que aisle e intérprete los resultados obtenidos.

4-Realizar pruebas serológicas para la identificación de las principales

Enterobacterias patógenas.

5-Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las

tablas de referencia para la identificación de Enterobacteriaceae.

MUESTRA:

Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:

Heces frescas (la mejor muestra)
Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
Material obtenido por proctoscopia.
Biopsia de mucosa intestinal.

Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos.

Las heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de

2-3horas de ser emitidas.

El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.

En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En niños, introducir el hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas.

Cuando las heces, que se encuentran a 37°C dentro del intestino, son colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20°C),el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente.

Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Poresta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH.

Para éste propósito colocar con hisopo estéril una porción de las heces (con sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de transporte:Glicerol – Salino bufferado, (especialmente para Shigella).
   Caldo de Hagna GN (Gramnegativo).

Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.

Otros caldos de enriquecimiento como Selenito, no deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella sp, ya que su uso retrasa 24horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clínica.

La coloración de Gram en heces nunca debe practicarse por carecer de

significado clínico a menos que el médico lo solicite.

PROCEDIMIENTO:

Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma desulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfídrico.

El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos-diferenciales de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen

EFECTUAR EL COPROCULTIVO DE LA SIGUIENTE MANERA:

1.Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o demuestra similar, directamente en una caja de Mac Conkey y una caja de SS.El inóculo se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en lascajas de ambos medios. Inocular sólo ½ cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el Mac Conkey.

2.Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas mientras la otra se enfría.

3.Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas, incubar a 36°C por 18 a 24 horas.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1.Después de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe contarse

con una luz de lámpara que ilumine las cajas por detrás y observarlas. Marcar por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sospechosas así: primero Mac Conkey escoger colonias lactosa-negativo (incoloras). Si el paciente es un niño menor de un año, se marcaran colonia típica de Escherichia colí (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa).

Examinar el SS de la misma forma, en este medio el crecimiento será más escaso ya que es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia lactosa-negativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (ácido ulfhídrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequeña

verde azulado (lactosa-negativo).

2.Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa

en aguja bien recta, flameada y fría, toque la superficie de la colonia seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flameé la boca del tubo, luego pínche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y estríe rápido y parejo en la superficie inclinada. Flameary con la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estríe la superficie del medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo metilo y el Voges Proskauer.

   3.- Incube a 36°C la gradilla que contiene las bioquímicas. Deben permanecer en incubación de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno. 

   4.Examine las reacciones e interprete los resultados de acuerdo a la tabla de

identificación de pruebas bioquímicas.

5.Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma)

M.V.Z. JORGE ISIDRO SAMANIEGO BELTRÁN

SINALOA MÉXICO 5 DE ABRIL 2013

http://www.scribd.com/doc/6617222/Manual-de-Bacteriologia