CULTIVOS EN MICROBIOLOGIA

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

La evolución de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Tipos básicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado físico:

líquidos

semisólidos

sólidos

atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

Bibliografía

http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

ACTIVIDAD DE EVALUACIÓN

COCOS GRAMPOSITIVOS 

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.

INTRODUCCÓN

El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal, incluyendo estreptococos, estafilococos, neiserias, difteroides, levaduras y bacilos entéricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos se aíslan en agar enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemolítica, parcial (alfa hemólisis) o total (beta hemólisis)

El género Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades microscópicas, morfológicas coloniales y bioquímicas. S. aureus es el único coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentación amarilla si se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es muy resistente a la acción del calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes químicos, sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de aquél, S. epidermidis es coagulasa negativo, no-hemolítico.

Antigénicamente, los estreptococos presentan 13 grupos (clasificación de

Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denominados de

la A a la O.

Los estreptococos del grupo A, también denominados Streptococcus pyogenes constituyen la causa más común de faringitis en humanos. Al crecer en medio de cultivo forman colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolíticas y son los más virulentos. La proteína M es el principal antígeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus.

Los estreptococos del grupo B incluyen a S. agalatiae y dan la prueba de CAMP positiva: una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unión de su crecimiento con S. aureus.

Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB.

El Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y beta hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que presentan una gran cápsula, lo que constituye su factor de virulencia. Es difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la Optoquina.

MATERIALES Y METODOS

I. Aislamiento e identificación de cocos gram-positivos

1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo estéril en la forma tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar sangre.

Extienda el inóculo con un asa por estría cruzada. Incube a 37 C por 24 hs.

2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo en un portaobjetos y haga un frotis. Tiña con gram.

3. Simultáneamente, Haga un Gram de cepas control de Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae.

Observe al microscopio.

4. Siembre las cepas control en agar sangre. Incube a 37 C por 24 hs.

5. Haga una tinción de Gram con las cepas control.

6. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias produjeron hemólisis y de qué tipo.

7. Haga un gram de las colonias del exudado.

8. Para la cepa control de S. aureus y las colonias semejantes a S. aureus o a Staphylococcus sp., desarrolladas del exudado faringeo, haga las siguientes pruebas:

 - Prueba de la catalasa: tome una colonia bien aislada con el asa estéril y sumérjala en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por desprendimiento del O2.

 - Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el resultado. Si hay coagulación del plasma, es coagulasa positivo.

 - Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el asa estéril una colonia bien aislada, beta hemolítica y siémbrela en una placa de sal-manitol-agar por estría cruzada. Incube a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y el cambio de color del medio a amarillo. Esto, debido a la fermentación de la lactosa y acidificación.

9. Para S. pyogenes (estreptococos del gpo. A) y en las colonias semejantes del exudado, determine su sensibilidad a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en la mitad de una placa de agar-sangre y coloque un círculo de papel filtro impregnado con Bacitracina

10. En el otro sector de la caja, coloque un círculo impregnado con Trimetroprin para determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine el diámetro del halo de inhibición alrededor de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.

11. Para la identificación del estreptococo beta hemolítico del gpo. B

(Streptococcus agalactiae), realice la prueba de CAMP, en la forma siguiente:

- Tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola línea perpendicular a otra línea previamente sembrada con S. aureus. Incube a  37C durante 24 hs.

Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, en el lugar donde se unen las dos bacterias.

12. Para identificar S. pneumoniae, practique en las colonias semejantes al control  positivo la prueba de la optoquina, colocando un círculo de papel impregnado con el antibiótico en un medio con agar-sangre donde se sembró la bacteria.

Incube a 37 C por 24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la sensibilidad.

13.En todos los experimentos compare los resultados de las colonias sospechosas con los de las cepas control.

II. Prueba de las estreptolisinas

Esta prueba es utilizada para detectar infecciones por Streptococcus Gpo. A causante de faringitis, glomerulonefritis, fiebre reumática, endocarditis bacteriana y fiebre escarlatina, proceso que demuestra la presencia de anticuerpos generados contra la enzima estreptolisina O, producida por la bacteria y que causa hemolisis de eritrocitos. Los anticuerpos antiestreptolisinas pueden detectarse en la sangre durante semanas o meses después de que desapareció la fuente primaria de la infección.

Procedimiento:

1. Siga las instrucciones del juego de reactivos de inmunodiagnóstico y  reconstituya el frasco de estreptolisina.

2. Como fuente de eritrocitos use sangre humana o de conejo, recién obtenida y desfibrinada. Para lavarlos diluir la sangre 1:1 con NaCl 0.85 % . Puede utilizar 6 ml de cada uno. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y repetir la operación de lavado con NaCl tres veces, hasta quedar el sobrenadante incoloro.

3. Eliminar el sobrenadante y resuspenda 1 ml del paquete de eritrocitos en 19 ml de la solución amortiguadora, para quedar al 5 %.

4. Para la prueba de estreptolisinas obtenga sangre del paciente y separe el suero.

5. Diluya el suero del paciente 1: 75, colocando 7.4 ml de solución amortiguadora para streptolisina y 0.1 ml de suero.

6. En seis tubos de ensayo de 12 x 75 mm coloque las siguientes cantidades de solución amortiguadora:

No. del tubo ml de sol.

Amortiguadora

1 0.0                     2 0.2                 3 0.2              4 0.2          5 0.2          6 0.2

7. Coloque suero diluido en los tubos, en las siguientes cantidades:

Coloque 0.2 ml en el tubo #1.

Coloque 0.2 ml en el tubo #2. Mezcle y pase 0.2 ml al tubo #3. Mezcle y  pase 0.2 ml al Tubo #4. Mezcle y pase 0.2 ml al tubo #5. Mezcle y pase  0.2ml al tubo#6. Mezcle y descarte 0.2 ml.

8. En cada tubo adicione 0.1 ml de sol. de estreptolisina, mezcle e incube a 37 C por 15 min.

9. En cada tubo adicione 0.1 ml de suspensión de glóbulos rojos al 5% y mezcle suavemente. Incube a 37 C por 15 min. Agite suavemente y vuelva a incubar a 37 C por 30 min.

10. Centrifugue a 1000-1500 r.p.m. durante 1 minuto.

11. Para la lectura de hemólisis, se toma como como el número de unidades de estreptolisinas, la dilución en el último tubo que no presentó hemólisis.

No. del tubo Unidades

1                    75

2                    150

3                   300

4                   600

5                   1200

6                   2400

12. Se deben utilizar controles de glóbulos rojos, de estreptolisina y un suero con título conocido de antiestreptolisinas.

 - Glóbulos rojos: 1.5 ml de sol. Amortiguadora + 0.5 ml de eritrocitos

 - Estreptolisina: 1.5 ml de sol. Amortiguadora + 0.5 ml de eritrocitos +  0.5 ml de estreptolisinas

 - Suero de título conocido: sol. Amortiguadora + suero conocido +

 Estreptolisina + eritrocitos, en cantidades iguales a las de la  prueba.

- Valores normales: el nivel es usualmente menos de 160 unidades  Todd por mililitro.

BIBLIOGRAFIA

M.V.Z. JORGE ISIDRO SAMANIEGO BELTRAN

INV. Ciencias naturales y estudios de microbiología, cln, Sinaloa México  octubre 2014

MORFOLOGÍA DE LOS VIRUS

MORFOLOGÍA DE LOS VIRUS

Hacia fines del siglo pasado se formuló la teoría de que cada enfermedad era producida por un germen específico. Hasta ese momento los patólogos estaban convencidos de que para cada enfermedad sería posible encontrar el microorganismo responsable, utilizando las siguientes técnicas: a) observación del germen con la ayuda del microscopio, b) cultivo sobre un medio nutritivo y c) retención por filtros. Sin embargo, en 1892, Iwanowski (o Ivanovsky?) pudo demostrar que el agente productor de la enfermedad del mosaico de tabaco pasaba a través de los filtros para bacterias y no podía ni verse ni cultivarse. Luego en 1898 Beijerinck, determinó que la enfermedad del mosaico del tabaco era provocada por un nuevo agente infeccioso a los que denomino virus filtrables (virus: palabra de origen latino que significa veneno). Los virus están ampliamente distribuidos en la naturaleza y afectan a todo tipo de organismos, tanto del reino animal, vegetal o protista. 

La estructura de los virus está integrada por dos tipos de macromoléculas: ácidos nucleicos y proteínas, los que forman las partículas virales o viriones. Básicamente existen dos tipos de partículas virales: partículas virales simples (virus desnudo) o partículas virales envueltas (virus envuelto). El virus desnudo consta de un ácido nucleico (genoma) asociado a proteínas y una cubierta proteica o cápside. Por otra parte los virus envueltos añaden a esta estructura básica una envoltura lipoproteína de origen celular. La función de la cápside es de servir al ácido nucleico como protección y vehículo. 

Postulado de Lwoff 

"Únicamente serán considerados virus aquellos agentes infecciosos cuya partícula elemental contenga un solo tipo de ácido nucleico". Es decir poseen ARN o ADN, pero no ambos tipos de ácidos nucleicos funcionales a la vez. Por lo tanto los virus pueden ser ADN o ARN virus. Debido a la estructura simple de virus, para su multiplicación dependen en forma absoluta de la célula huésped que infectan. Por lo tanto consideraremos a los virus como parásitos intracelulares obligados. 

♠ Replicación viral

La célula huésped, una vez infectada, sintetizará nuevas moléculas de ácido nucleico viral, ya que el genoma viral tomara el control de las actividades metabólicas de la célula. Bajo este control, también se producirán gran cantidad de proteínas virales. De esta manera el ensamblado de nuevas partículas virales provendrá de la asociación de las nuevas moléculas de ácido nucleico viral con las proteínas. Este proceso es muy diferente de la reproducción celular, tanto de los procariontes como de los eucariontes. Por lo tanto es más apropiado hablar de REPLICACION VIRAL. 

♠Los virus como parásitos intracelulares

Hasta el momento no se ha podido demostrar que ningún virus aislado pueda utilizar o almacenar energía mediante procesos similares a la respiración, tampoco pueden sintetizar proteínas. Es decir no tienen metabolismo propio, dependiendo en forma absoluta del medio ambiente celular. 
El parasitismo de los virus se ejerce a nivel genético, ya que el genoma viral dentro de la célula desplaza al genoma de la célula hospedadora del control celular. 

♠Provirus

Anteriormente hemos explicado que los virus, infectan las células y hacen réplicas de sí mismos. Luego abandonan la célula huésped y pasan a otra, recomenzando su ciclo. Pero también puede ocurrir que el genoma viral se integre al ADN del huésped. Cuando el genoma viral se integra al genoma celular y se replica junto con este se lo denomina PROVIRUS. Un provirus puede activarse espontáneamente o bien expuesto a diversos estímulos, una vez activado puede inducir la producción de virus completos. Los provirus pueden modificar la morfología celular y su metabolismo, esto puede deberse a la producción de alguna proteína viral. Estos cambios en la estructura celular, generalmente asociados a cambios en la membrana celular, inducidos por un provirus reciben el nombre de transformación. En algunos casos estas células transformadas por los provirus pueden ser cancerosas.

 
♠Los virus como agentes infecciosos

El parasitismo celular obligado es la causa básica por la cual un virus puede causar daño. La relación que establece un virus y su célula huésped es variable. El resultado de la interacción depende tanto del virus en cuestión como de la célula huésped. Por ejemplo, se denominan virus citocídicos, a los que como resultado de su multiplicación, producen una rápida inducción hacia la muerte celular. Por otra parte se encuentran los virus no citocídicos, que son aquellos que no provocan la muerte celular. Ejemplos de virus no citocídicos serían los virus moderados y los virus oncogénicos. Los virus moderados son aquellos que producen partículas virales y no producen la muerte celular. Han llegado con la célula huésped a un estado de equilibrio más o menos estable. Luego están los virus oncogénicos, capaces de estimular la división celular, estos cambios pueden ser irreversibles si la célula pierde la capacidad de regular su ciclo celular. Este estado se denomina transformación celular.

Los virus no citocídicos pueden causar dos tipos de infecciones: 1- Las infecciones latentes, donde el virus permanece sin manifestarse, alojado en células no productoras. Ante determinados estímulos, estrés, enfermedades, exposición a la luz solar, el virus se reactiva, recomenzando la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas virales. Ejemplos: L Herpes simplex, Varicela zoster. 2- Las infecciones crónicas, donde de una persona enferma siempre es posible obtener virus infeccioso, aun por periodos muy prolongados de tiempo. Por ejemplo, virus de la hepatitis B, Epstein-Barr, virus de la rubéola. 

Morfología viral

Los virus poseen gran variedad de formas y tamaños. Por ejemplo los virus que al microscopio electrónico aparecen aproximadamente esféricos se denominan isométricos. En estos virus el ácido nucleico está rodeado por una cápside (caja) proteica. Las subunidades estructurales que forman la cápside, visibles al microscopio electrónico, se denominan capsómeros. A su vez los capsómeros están formados por subunidades proteicas. La cápside por su naturaleza antigénica es la que determina la identidad viral. 

El ácido nucleico viral no se encuentra desnudo, sino que está asociado a proteínas distintas de las de la cápside, cuya función puede ser estructural (plegado del ADN) o enzimática (polimerasa). Al conjunto de ácido nucleico y proteínas asociadas se lo denomina "core". Por ultimo diremos que los virus donde la cápside rodea directamente al ácido nucleico (es decir que no hay un "core" evidente), el conjunto de cápside y ácido nucleico recibe la denominación de nucleocápside. 

Genoma viral

El genoma, que puede encontrase en los distintos tipos de virus, puede sistematizarse de acuerdo a diversos criterios:

1-     Tipo de ácido nucleico: ADN o ARN

2- Polaridad o sentido: + o - (aplicado principalmente a los ARN virus)
3- Número de cadenas: monocatenario o bicatenario
4- Genoma circular o desnudo
5- Genoma entero o fragmentado 

Debemos recordar que las cadenas de un ácido nucleico de doble cadena, son de polaridad (sentido) opuesto. Por convención se considera que si una tiene sentido + la otra será -. 
De acuerdo a este criterio se considera que un virus es + (o cadena +), cuando su genoma monocatenario tiene la misma polaridad que un ARNm. Es decir el mismo genoma viral, puede actuar dentro de la célula como ARNm y llevar a cabo directamente la síntesis de proteínas virales. Los "virus +", pueden infectar con el ácido nucleico solo, salvo los retrovirus que siendo +, necesitan una transcriptasa reversa asociada al genoma para poder infectar. Por el contrario, se denomina "virus -" cuando el genoma no puede actuar directamente como mensajeros. El ARN - puede actuar como molde, para la síntesis de ARN +, el ARNm viral. 

Los Bacteriófagos son virus específicos de las bacterias. Bacteriófagos, significa que se "alimenta" o multiplica a expensas de bacterias.

Los Bacteriófagos que infectan células huésped, pueden establecer dos tipos de procesos: 
1- Ciclo Lítico: en este tipo de ciclo el virus produce inmediatamente gran cantidad de ácidos nucleicos virales y proteínas de la cápside. Estos se ensamblan produciendo nuevas partículas virales que son liberadas al medio al producirse la lisis celular. 

2-     Ciclo Lisogénico: en este ciclo la relación entre célula huésped y virus, puede prolongase por periodos variables de tiempo. El virus integra su genoma al cromosoma bacteriano, replicándose conjuntamente el ácido nucleico del parásito y el del huésped. Un virus bacteriano integrado al cromosoma se denomina profago. Por lo tanto el profago se replica junto con el ADN bacteriano. En determinadas circunstancias (por ejemplo ruptura del ADN bacteriano por luz ultravioleta o agentes químicos), el profago se activa, y comienza la producción de ácido nucleico viral y proteínas virales, produciendo luego la lisis celular. Las bacterias que portan profagos se denominan lisogénicas. Los Bacteriófagos que pueden integrarse como profagos y que no lisan inmediatamente a las células se denominan fagos atenuados. 

Los virus como vectores

1-    
Los virus pueden servir como vehículos (vectores), para transferir material genético de una célula a otra. Este fenómeno se denomina transducción. Durante el ciclo lítico, el ADN del huésped queda fragmentado y alguno de esos fragmentos puede ser tomado al azar y quedar dentro de la cápside. De esta forma, cuando el virus infecta una nueva célula, transporta genes de una antigua célula huésped a otra nueva. 

Ciclo Vital Intracelular de un retrovirus 

Empieza cuando un virión o partícula vírica, se une a la superficie externa de una célula susceptible. Este primer estadio del ciclo se lo denomina adsorción. Luego el virus fusiona su envoltura lipoproteína con la membrana celular, introduciendo en la célula su nucleocápside junto con el ARN que constituye su dotación genética. En cada partícula viral se encuentran dos cadenas de ARN vírico. A este proceso se lo conoce como penetración. 
La enzima transcriptasa inversa es una ADN polimerasa que primero produce una copia de ADN simple cadena que a continuación se copia a si misma obteniéndose ADN doble cadena. Por lo tanto este ADN doble cadena se obtuvo a partir de ARN. La síntesis del ADN doble cadena ocurre junto con la degradación del ARN original. El ADN doble cadena (provirus), emigra hacia el núcleo y se integra en el propio ADN celular. La integración de este ADN doble cadena en el cromosoma del huésped es necesaria para la síntesis de nuevas moléculas de ARN, por la ARN polimerasa celular, ya que el virus carece completamente de la maquinaria metabólica necesaria para realizar la transcripción y la síntesis de proteínas necesarias para la cápside y la misma transcriptasa reversa. 

MEDIOS DE CULTIVOS BACTERIANOS

INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.

Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.

En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser

preparados en forma líquida o en forma sólida.

Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: 

• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal,

las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos
no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Trabajo Práctico Nº 6
PREPARACIÓN DE
MEDIOS DE CULTIVO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
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9. 2
• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.
De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:
• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
• Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA – PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
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fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).
Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.
OBJETIVO
Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de:
Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de medios de cultivo deshidratados.
Indicar el método de esterilización apropiado.
FUNDAMENTO
La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos
en el laboratorio.
PROCEDIMIENTO
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.
2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes.
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Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.
3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.
4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C).
Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la solución correspondiente pero 1 N.
5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor.
6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución y fecha de preparación.
7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones señaladas en el trabajo práctico N° 8.
Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.

RESULTADOS
MEDIO DE CULTIVO: ____________________________________
CANTIDAD PREPARADA: _________________________________
CANTIDAD PESADA:
CÁLCULOS
pH inicial: _______________ pH final: ________________
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ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO:
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ESTADO FÍSICO:
􀀀 Sólido 􀀀 Líquido
TIPO DE MEDIO DE CULTIVO
• Según la naturaleza de los ingredientes:
* Natural o complejo 􀀀 Sintético
• Según el propósito de uso
􀀀 Enriquecimiento 􀀀 Selectivo 􀀀 Diferencial 􀀀 Otro
DISTRIBUCIÓN: __________________________________________________
CONDICIONES DE ESTERILIZACIÓN: _________________________________
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: _______________________________

BIBLIOGRAFÍA
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales
(2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
Merck. 2002. Microbiology Manual

Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A. México D.F.

Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa. Prof. Alessandra Garcés Octubre 2001. Prof. Katiuska Saravia
Revisión

TÉCNICA PARA LA TINCIÓN DE GRAM

16 DE septiembre 2014

Tinción de Gram

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra de líquido cerebroespinal. Si hubiera una especie de bacteria Gram negativa, apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

Una tinción Gram en la que observamos un mezclado deStaphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (baciloGram negativo)

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

Metodología             Recoger muestras.

·         Hacer el extendido con un palillo de madera.

·         Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.

·         Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)

·         Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las células gram positivas se tiñen de color azul-púrpura.

·         Enjuagar con agua.

·         Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.

·         Enjuagar con agua.

·         Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos o 5 según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración).

·         Enjuagar con agua.

·         Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Explicación[editar]

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I₂ (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I₂/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.

Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gram negativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.

El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram.

La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.

Teorías[editar]

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células compositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y Stearn, los microorganismos gram positivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gram negativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

·         Los microorganismos gram positivos pueden hacerse gram negativos al aumentar la acidez.

·         Los microorganismos gram negativos pueden hacerse gram positivos al aumentar la alcalinidad.

·         Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gram negativos por aumentar la alcalinidad.

·         Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gram negativos por aumentar la acidez.

·         En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.

·         Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.

·         La materia grasa extraída de los microorganismos gram positivos difiere de la obtenida de los microorganismos gram negativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.

·         El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente gram positivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprobó que los microorganismos gram positivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia gram positiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gram negativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción gram positiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes gram positivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.

La pared celular de los microorganismos gram positivos y gram negativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción gram positiva consiste esencialmente en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos gram positivos, a diferencia de la de los gram negativos, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.

Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.

Los pasos que se han de seguir para realizar la tinción son los siguientes:

1º Fijamos la muestra mediante calor.

2º Violeta cristal (Tiñe todas las baterías, gram + y -) 1´.

3º Fijamos con Lugol, 1´.

4º Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona (los gram - se decoloren).

5º Safranina (colorante de contraste, tiñe a los gram -), 1´.

Los tiempos para aplicar cada colorante es orientativo. En la tinción se observarán de color azul-violeta las gram + y de color rosa las gram -.

Bacterias resistentes a la tinción Gram

Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva, tiñen como gram negativas:

·         Mycobacterias (están encapsuladas).

·         Mycoplasmas (no tienen pared).

·         Formas L (pérdida ocasional de la pared).

·         Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).

Utilidades

En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

·         Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

·         Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación.

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.

También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido ylipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta.

Causas que alteran la tinción de Gram

·         I: Edad de la bacteria.

·         II: Errores del operador.

·         III: Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas),Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).

Fuentes

Bibliografía

·         Aulton Michael E., Ciencia y diseño de formas farmacéuticas, 2° edición, Ed. Elsevier España, 2004.

·         Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7.

·         Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2.

·         Søgaard M, Nørgaard M, Schønheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.