COCOS GRAMPOSITIVOS
OBJETIVO
DE LA PRÁCTICA
Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.
INTRODUCCÓN
El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos
de la flora normal, incluyendo estreptococos, estafilococos, neiserias, difteroides,
levaduras y bacilos entéricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos
se aíslan en agar enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas
especies presentan capacidad hemolítica, parcial (alfa hemólisis) o total (beta
hemólisis)
El género Staphylococcus se
separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades microscópicas,
morfológicas coloniales y bioquímicas. S. aureus es el único coagulasa positivo
y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentación amarilla si
se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es muy resistente a la
acción del calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes químicos,
sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a
altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos preservados. En
sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador del pH a
amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de aquél, S. epidermidis
es coagulasa negativo, no-hemolítico.
Antigénicamente, los estreptococos presentan 13 grupos
(clasificación de
Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y
son denominados de
la A a la O.
Los estreptococos del grupo A,
también denominados Streptococcus pyogenes constituyen la causa más común de
faringitis en humanos. Al crecer en medio de cultivo forman colonias de 1-2 mm,
sin color, muy transparentes, beta hemolíticas y son los más virulentos. La
proteína M es el principal antígeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la
Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o
pus.
Los estreptococos del grupo B
incluyen a S. agalatiae y dan la prueba de CAMP positiva: una hemólisis marcada
en forma de punta de flecha en el punto de unión de su crecimiento con S.
aureus.
Streptococcus faecalis (gpo. D)
es el único que crece en EMB.
El Streptococcus pneumoniae
(Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y desarrolla colonias de
1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y beta
hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido
a que presentan una gran cápsula, lo que constituye su factor de virulencia. Es
difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la Optoquina.
MATERIALES Y METODOS
I. Aislamiento e identificación de cocos gram-positivos
1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo
estéril en la forma tradicional y deposite la muestra en el extremo de una
placa de agar sangre.
Extienda el inóculo con un asa por estría cruzada. Incube a
37 C por 24 hs.
2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo
en un portaobjetos y haga un frotis. Tiña con gram.
3. Simultáneamente, Haga un Gram de cepas control de
Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp, Streptococcus pyogenes y
Streptococcus pneumoniae.
Observe al microscopio.
4. Siembre las cepas control en agar sangre. Incube a 37 C
por 24 hs.
5. Haga una tinción de Gram con las cepas control.
6. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias
produjeron hemólisis y de qué tipo.
7. Haga un gram de las colonias del exudado.
8. Para la cepa control de S. aureus y las colonias
semejantes a S. aureus o a Staphylococcus sp., desarrolladas del exudado
faringeo, haga las siguientes pruebas:
- Prueba de la catalasa: tome una colonia bien
aislada con el asa estéril y sumérjala en una gota de agua oxigenada. Observe
una efervescencia por desprendimiento del O2.
- Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril
obtenga una colonia beta hemolítica bien aislada y mézclela con 0.5 ml de
plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el resultado. Si hay coagulación del
plasma, es coagulasa positivo.
- Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el
asa estéril una colonia bien aislada, beta hemolítica y siémbrela en una placa
de sal-manitol-agar por estría cruzada. Incube a 37 C durante 24 hs. Observe el
desarrollo de colonias color dorado y el cambio de color del medio a amarillo.
Esto, debido a la fermentación de la lactosa y acidificación.
9. Para S. pyogenes (estreptococos
del gpo. A) y en las colonias semejantes del exudado, determine su sensibilidad
a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en la mitad de una
placa de agar-sangre y coloque un círculo de papel filtro impregnado con Bacitracina
10. En el otro sector de la caja,
coloque un círculo impregnado con Trimetroprin para determinar su resistencia.
Incube a 37 C por 24 hs. Determine el diámetro del halo de inhibición alrededor
de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.
11. Para la identificación del
estreptococo beta hemolítico del gpo. B
(Streptococcus agalactiae), realice la prueba de CAMP, en la forma
siguiente:
- Tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola
línea perpendicular a otra línea previamente sembrada con S. aureus. Incube
a 37C durante 24 hs.
Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, en el lugar
donde se unen las dos bacterias.
12. Para identificar S. pneumoniae, practique en las colonias
semejantes al control positivo la prueba
de la optoquina, colocando un círculo de papel impregnado con el antibiótico en
un medio con agar-sangre donde se sembró la bacteria.
Incube a 37 C por 24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la
sensibilidad.
13.En todos los experimentos compare los resultados de las colonias
sospechosas con los de las cepas control.
II. Prueba
de las estreptolisinas
Esta prueba es utilizada para
detectar infecciones por Streptococcus Gpo. A causante de faringitis,
glomerulonefritis, fiebre reumática, endocarditis bacteriana y fiebre
escarlatina, proceso que demuestra la presencia de anticuerpos generados contra
la enzima estreptolisina O, producida por la bacteria y que causa hemolisis de
eritrocitos. Los anticuerpos antiestreptolisinas pueden detectarse en la sangre
durante semanas o meses después de que desapareció la fuente primaria de la infección.
Procedimiento:
1. Siga las instrucciones del juego de reactivos de inmunodiagnóstico
y reconstituya el frasco de
estreptolisina.
2. Como fuente de eritrocitos use sangre humana o de conejo, recién
obtenida y desfibrinada. Para lavarlos diluir la sangre 1:1 con NaCl 0.85 % .
Puede utilizar 6 ml de cada uno. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min. Eliminar
el sobrenadante y repetir la operación de lavado con NaCl tres veces, hasta
quedar el sobrenadante incoloro.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspenda 1 ml del paquete de
eritrocitos en 19 ml de la solución amortiguadora, para quedar al 5 %.
4. Para la prueba de estreptolisinas obtenga sangre del paciente y
separe el suero.
5. Diluya el suero del paciente 1: 75, colocando 7.4 ml de solución
amortiguadora para streptolisina y 0.1 ml de suero.
6. En seis tubos de ensayo de 12 x 75 mm coloque las siguientes
cantidades de solución amortiguadora:
No. del tubo ml de sol.
Amortiguadora
1 0.0 2 0.2 3 0.2 4 0.2 5 0.2 6 0.2
7. Coloque suero diluido en los tubos, en las siguientes cantidades:
Coloque 0.2 ml en el tubo #1.
Coloque 0.2 ml en el tubo #2. Mezcle y pase 0.2 ml al tubo #3. Mezcle
y pase 0.2 ml al Tubo #4. Mezcle y pase
0.2 ml al tubo #5. Mezcle y pase 0.2ml
al tubo#6. Mezcle y descarte 0.2 ml.
8. En cada tubo adicione 0.1 ml de sol. de estreptolisina, mezcle e
incube a 37 C por 15 min.
9. En cada tubo adicione 0.1 ml de suspensión de glóbulos rojos al 5%
y mezcle suavemente. Incube a 37 C por 15 min. Agite suavemente y vuelva a
incubar a 37 C por 30 min.
10. Centrifugue a 1000-1500 r.p.m. durante 1 minuto.
11. Para la lectura de hemólisis, se toma como como el número de
unidades de estreptolisinas, la dilución en el último tubo que no presentó
hemólisis.
No. del tubo Unidades
1 75
2 150
3 300
4 600
5 1200
6 2400
12. Se deben
utilizar controles de glóbulos rojos, de estreptolisina y un suero con título
conocido de antiestreptolisinas.
- Glóbulos rojos: 1.5 ml de sol. Amortiguadora
+ 0.5 ml de eritrocitos
- Estreptolisina: 1.5 ml de sol. Amortiguadora
+ 0.5 ml de eritrocitos + 0.5 ml de
estreptolisinas
- Suero de título conocido: sol. Amortiguadora
+ suero conocido +
Estreptolisina + eritrocitos, en cantidades
iguales a las de la prueba.
- Valores
normales: el nivel es usualmente menos de 160 unidades Todd por mililitro.
BIBLIOGRAFIA
M.V.Z. JORGE ISIDRO SAMANIEGO BELTRAN
INV. Ciencias naturales y estudios de
microbiología, cln, Sinaloa México octubre 2014
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