PORTAFOLIO 1 SEGUNDO BLOQUE

Coprocultivo

1 – OBJETIVO

Identificar las posibles especies patógenas de microorganismos presentes en las vías gastrointestinales (Heces) a través del coprocultivo y de sus reacciones bioquímicas.

2 - FUNDAMENTO

La porción inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios ( Bacteroides, bácilos gram positivos, Estreptococos), microorganismos entéricos gran negativos y Enterococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patógenas de las heces implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través del empleo de medios selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos. Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos entéricos gran negativos invasores, los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias. La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes del mundo.
Las heces y los raspados rectales son los especimenes de que se dispone con mayor facilidad. Debe anotarse, en el examen macrocópico la presencia de sangre, moco o helmintos en la inspección inicial. Se suspenden los especímenes en un caldo selectivo como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios así como en medios selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para permitir la separación de los bacilos gran negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entéricas comunes.
Los frotis teñidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos microorganismos anormales como Cándida o estafilococos, pero no pueden utilizarse para diferenciar las bacterias entéricas patógenas de las de la flora normal, por lo que deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en la muestra como son las pruebas bioquímicas.

3. MATERIAL

·         Agua destilada

·         Gradilla

·         Tubos de ensayo

·         Asa de siembra desechable y normales

·         Hisopo

·         Papel de filtro

·         Pipetas de vidrio

·         Medios de cultivo

·         Pinzas metálicas

·         Alcohol

·         Algodón graso

·         Vaso de precipitado

·         Mechero Bunsen

·         Portaobjetos

·         Cubreobjetos

·         Microscopio

·         Cubeta de tinción

·         Pinzas de madera

·         Frasco lavador

3.2 Reactivos:

·         Medios de cultivo para aislamiento:

– agar sangre
– agar Mc Conkey
– Agar entérico Hektoen (HK)

·         Medios para pruebas bioquímicas:

- Agar Christensen
- KIA

·         Colorantes para tincion de Gram: lugol, cristal violeta, fucsina básica, alcohol

·         Lugol o Negro sudán

3.3 Muestras:

Muestra: heces de adulto.

4. PROCEDIMIENTO

El procedimiento fue el siguiente:

1.     Recogida de la muestra

Preparación o indicaciones del paciente:

Se debe seguir con el régimen habitual de comidas.

a. para niños/as

Para bebés y niños pequeños que usan pañales:

Se puede cubrir el pañal con un envoltorio plástico. Si se coloca correctamente el envoltorio plástico, separando las heces de la orina, se puede evitar que éstas se mezclen con el fin de obtener una muestra mejor.

b. para adultos

Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plástico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el asiento. Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para recolección de la muestra trae una gasa especial que se usa para recogerla y luego se coloca la muestra en un recipiente limpio.

B. Condiciones para la toma de muestras.- Heces que no tengan más de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto con un hisopo de algodón. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1º ml de un líquido conservador, o bien, depositar en éste el hisopo rectal.

§ Muestra de heces de 12 o 24 hrs.

Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es necesaria la esterilidad. El análisis se hará en las 12 horas siguientes a la deposición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C. Si el análisis se pospone más de 24 horas se añadirá un volumen igual al de las heces de una solución acuosa al 5% de formol comercial.

C. Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio.

- Evitar contaminación por material no estéril.

- Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.

- Etiquetar muestra adecuadamente.

-Temperatura de conservación: 4°C para evitar la proliferación bacteriana.

2. Examen macroscópico de la muestra 

Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin digerir.

3. Examen y en fresco. 

Observación en el microscopio: lugol- fresco:

En fresco: Colocamos una gota diluida en agua destila de la muestra en un portaobjetos y colocamos un cubre encima.

Se realiza una dilución en un tubo de ensayo con una pequeña cantidad de heces recogida con la ayuda de un asa de siembra desechable y se le añade un poco de agua destilada, se agita un poco y se obtiene una gota de esta dilución. Dicha gota la colocamos en un portaobjetos y añadimos una gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima para su posterior observación al microscopio.
Otro método de observación es realizando el mismo procedimiento pero sustituyendo el lugol por el

 negro sudan. Esta tinción está indicada para la observación de grasa.

Prueba de parasitología:

Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parásitos. En nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una sintomatología como diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores cólicos, elevación de eosinófilos en sangre u otros síntomas.

En el examen de parasitología se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se agrega una gota de lugol.

Con un bote de muestra colocar una gasa y añadir 50 ml de suero fisiológico para poder filtrar dicha muestra. Al liquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y se centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el sedimento que observaremos con una gota de lugol añadida para poder observar mejor.

4. Realización de medios de cultivo y siembra 

1. Medios de cultivo utilizados y su utilidad. 

	Medios	ml/gr	Autoclavar	Recipiente en el que se vierte	Utilidad
Aislamiento	Agar Mac Conkey	25/1.25	Si	Placa	aislamiento de bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos. diferencia bacterias que utilizan o no, lactosa.
	Agar entérico Hektoen	25/75.1	No	Placa	Medio diferencial para aislamiento y diferenciación de gram-negativos entéricos (Salmonella y Shigella spp)
Pruebas bioquímicas	Agar Christensen	25/0.6	Si	Tubo	diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica. Identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.
	KIA	25/1.45	Si	Tubo	determinar si un Microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o ácido sulfhídrico.

Para la realización del medio Christensen, le añadimos 50ml al medio con la técnica de barry, para realizar la prueba de la ureasa.

6. Siembra e inoculación de placas
Se procede a realizar la siembra, en estría múltiple, con la ayuda de un asa de siembra, tomando una pequeña cantidad de incóculo de las heces, previamente diluido en suero, teniendo en cuenta de trabajar en condiciones lo más asépticas posibles. Se tapa la placa y se mete en la estufa en un periodo de 24-48 horas.

1.     Examen morfológico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscópicamente y al microscopio.

Las características físicas de las colonias son de gran ayuda en la identificación. Cada microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma, tamaño, textura, olor, brillo, etc. Existen colonias más o menos elevadas, con bordes enteros, estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubación necesario para que aparezcan las colonias también puede tener valor en la identificación. Las características de las colonias tampoco ofrecen un diagnóstico por si solas, pero dirigen los esfuerzos hacia un grupo más o menos amplio de microorganismos.

Hay colonias muy características, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso de las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo muy característico.

1.     Examen microscópico

Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa de Petri y se obtiene una pequeña muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca en un porta previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la muestra lo podremos realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y cuidando de no quemarnos lo haremos con la ayuda de una pinza de madera.

A continuación se procede a teñir la muestra.

Tinción azul de metileno:

El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el porta por el mechero varias veces. Luego se tiñe con el azul de metileno cubriéndola entera. Pasado 5 min. Se lava con agua destilada se deja secar y se procederá a observar en el microscopio con aceite de inmersión y en el objetivo de 100x.

Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. Así:

§ Presencia de leucocitos: La infección ha cursado con inflamación intestinal. Se trata por tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella.

§ ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamación por lo que la infección puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas (Vibrio cholerae).

Para realizar la tinción de Gram:

Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con tres colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca después en la cubeta para proceder a teñirla.

Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de lugol, 30 seg y 1 min de fucsina básica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante además del alcohol y se deja secar.
Esta tinción nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram – según sea la composición de su pared y apreciar visualmente su forma y organización.

1.     Realización de pruebas bioquímicas

Prueba KIA
Ø Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37ºC durante 18-24 horas. Observar. Con la prueba bioquímica del KIA hemos detectado la capacidad que tienen las enterobacteriáceas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, producción de gas y de ácido sulfhídrico.

B-GALACTOSIDASA
Ø Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la realizaremos preparando una suspensión densa del microorganismo en un tubo

donde añadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para después añadir el disco de ONPG. Incubaremos a 37ºC y leemos antes de 24h el resultado.

OXIDASA 
Ø Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reacción que produce cambiando de color.

CATALASA 
Ø Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un portaobjetos donde añadiremos una gota de peróxido de hidrógeno observando si produce o no burbujas.

UREASA 
Ø Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa después de una incubación a 37ºC con un cambio de color del indicador.

5.RESULTADOS

EXAMEN MACROSCOPICO DIRECTO DE LA MUESTRA

Cantidad: 13.20
Color: marrón oscuro
Olor: fecaloideo
Consistencia: dura y consistente
Forma: cilíndrica
Presencia de:
- moco: no
- sangre: no
- pus: no
- fragmento de carne: no
- fragmento de fécula: si
- trozos de mucosa epitelial: no
- falsas membranas: no

OBSERVACIÓN MICROSCOPIO EN FRESCO Y CON LUGOL

- En fresco: Morfológicamente se observan microorganismos Bacilos.
- Lugol: Se observa almidón tiñido de un suave color liláceo. No se observan parásitos.

EXAMEN MORFOLÓGICO DEL CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS CULTIVADAS MACROSCÓPICAMENTE Y AL MICROSCOPIO 
- Examen morfológico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscópicamente y al microscopio:

1. Agar sangre: Colonias redondas, borde entero, circular, color blanquecino.
2. Christensen: Colonias redondas, circular, convexa.
3. Kia: Se observa producción de Ácido en todo el tubo, burbujas, agrietamiento e incluso desplazamiento del medio.
4. McConkey: Colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y en caso de que fueran colonias sin color sería el caso contario.
5. Hecktoen: No creció nada en este medio en 24 horas puede ser debido a un periodo de incubación insuficiente o a la siembra con inoculo muy diluido.


TINCIONES

Con la tinción de Gram detectamos el tipo de bacteria que es, gracias a la diferenciación de su morfología.

Observación morfológica

AZUL DE METILENO

AGAR SANGRE

 
- Se observan diferentes agrupaciones de cocos: cocos, diplococos, tétrada, estreptococos, estafilococos.
McCONKEY 
- Se observa agrupaciones de bacilos teñidos de azul por el azul de metileno.
CHRISTENSEIN
- Se observan agrupaciones de cocobacilos teñidos de azul por el azul de metileno.

TINCION DE GRAM

CHRISTENSEIN 
- Se observan agrupaciones de cocobacilos Gram +.

McCONKEY 

- Se observan agrupaciones de bacilos Gram – , algunos presentan puntos de color azul en la zona terminal del bacilo. Esto puede ser debido a que se estuvieran dividiendo
por lo que al romperse la capa externa de peptidoglicano se pudo teñir con el colorante de violeta de genciana. También pueden ser restos de este mismo colorante al realizar la tinción.
AGAR SANGRE 

- Se observan cocos gram negativos ( rosados) en su mayoría, pero también se pueden observan algunos color azul del colorante violeta de genciana.

BACTERIAS ENCONTRADAS EN EL INTESTINO GRUESO DE HUMANOS.

BACTERIAS	Incidencia (%)	BACTERIAS	Incidencia (%)
Bacteroides fragilis	100	Escherichia coli	100
Bacteroides melaninogenicus	100	Salmonella enteritidis	3-7
Bacteroides oralis	100	Salmonella typhi	0.00001
Lactobacilos	20-60	Klebsiella species	40-80
Clostridium perfringens	25-35	Enterobacter species	40-80
Clostridium septicum	5-25	Proteus mirabilis	5-55
Clostridium tetan	1-35	Pseudomonas aeruginosa	3-11
Bifidobacterium bifidum	30-70	Peptostreptococcus	Común
Staphylococcus aureus	30-50	Peptococcus	Oderado
Streptococcus faecalis	100	Methanogens	Común

CUADROS DE RESULTADOS

MICROORGA-NISMO	MEDIO DE CULTIVO	TINCION DE GRAM	TINCION DE AZUL DE METILENO
Escherichia coli	Mac conkey	Bacilos Gram -	Bacilos
Peptostreptococcus	Agar sangre	Cocos, diplococos y estreptococos gram +	Cocos, diplococos y estreptococos
Peptococcus	Agar sangre	Cocos y racimos Gram +	Cocos y racimos
Streptococcus faecalis	Agar sangre	Coco Gram +	cocos

MICROORGANISMO	PRUEBAS BIOQUIMICAS
	B-GALACTOSIDASA	OXIDASA	KIA	CATALASA	UREASA
Peptostreptococcus		-		-
Peptococcus		-		-
Streptococcus faecalis		-		-
Escherichia coli	+	-	A/ A, G	+	-