ELABORACIÓN DE CULTIVOS BACTERIOLÓGICOS
PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y
COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS
OBJETIVO
Aprender las
técnicas de preparación del frotis, de fijación y coloración más utilizadas en
el estudio macroscópico de cultivos bacterianos, para poder así dar pauta a la
identificación de las principales formas bacterianas y comprender la
importancia de las tinciones y su adecuado uso.
FUNDAMENTO
Debido al pequeño tamaño
de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya
sea de campo claro o de campo oscuro para poder realizar la descripción de
estos.
El microscopio más común
es el de campo claro, en el cual la observación de células vivas es limitada,
debido a que estas son incoloras y permiten el paso de un gran cantidad de luz.
Debido a este factor, la
observación de frotis teñido es más recomendable.
Se denomina frotis a la
extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con
objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.
Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para
poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al
microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados.
Los frotis de cultivos
líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio que al
quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios
sólidos se fijan generalmente con calor.
MATERIAL
* Mechero de Bunsen
*Asa de siembra
* Portaobjetos
* Microscopio
* Pizeta
* Tubos de ensayo
* Centrifuga
MATERIAL BIOLÓGICO:
*Muestra biológica: heces fecales frescas y orina
* Cultivos bacterianos
REACTIVOS:
* Azul de metileno
* Alcohol etílico
* Fenol
* Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
1. Analizar macroscópicamente al medio de cultivo
2. Llenar a la mitad un tubo de ensayo con agua
destilada. Tomar un aplicador e introducirlo a la muestra de heces, tomando lo
mas mínimo posible de estas y disolver en el tubo con agua.
3. Tomar un poco de orina, depositarla en otro tubo
de ensayo y centrifugar durante 5 minutos a 3 000 rpm.
Preparación de frotis:
1. Lavar y secar perfectamente los
portaobjetos.
2. Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol.
3. Prender el mechero y esterilizar el asa en la
flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
4. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la
muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo
de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo,
introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
5. Del tubo de agua con un poco de heces disueltas,
se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la
suspension, que posteriormente se extiende en el portaobjetos.
6. Si hay sedimento en la orina, se decanta y se
extiende el sedimento en el portaobjetos, con ayuda del asa previamente
flameada.
7. Del tubo de
agua con un poco de heces disueltas, se flamea el asa, se deja enfriar y se
mete al tubo para tomar un poco de la suspensión, que posteriormente se
extiende en el portaobjetos.
8. Si
hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el porta
objetos, con ayuda del asa flameada.
Fijación del frotis:
1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos
gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas
alejadas del mechero).
2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente
secos se fijaran con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces
en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el
dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo
sobrecalentamiento.
Tinción simple:
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno
durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave
al agua corriente o con la ayuda de la pizeta con agua.
3. Dejar secar al aire
4. Observar la preparación al microscopio
localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el
objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.
OBSERVACIONES
En el medio de cultivo
agar sangre, se encontraban colonias puntiformes, blanquecinas, lisas, además
de que eran hemolíticas del tipo B.
En el otro medio
(amarillo) las colonias eran semejantes.
Frotis cultivo agar
sangre 100x
Todo el campo se
encontraba lleno de bacterias de morfología como de cocos, agrupados en
sarcinas, por ser cultivo de exudado vaginal, se trataba de Gardnerella
vaginalis.
Frotis heces 100x
Residuos de alimentos,E.
coli y además destaca lo que parecía ser un huevecillo, que por su morfología
semejaba al de una tenia.
Frotis orina, 100x
Distinguimos células
epiteliales de las vías urinarias, pero además en la que está ubicada
aproximadamente a las 10, se encuentran bacilos que la rodean.
RESULTADOS
En el frotis de orina y
heces se encontraron bacilos cortos, tratándose de Escherichia coli, una
enterobacteria, por eso es común encontrarla en heces.
En el medio de cultivo,
en el cual había sido sembrado exudado vaginal se tomó de la colonia que estaba
en el agar sangre, y tomando en cuenta las características macroscópicas y
microscópicas, se determinó que se trataba de la bacteria Gardnerella
vaginalis.
Es un bacilo inmóvil no
encapsulado, puede presentar fimbrias y es corto con una longitud de 0.5. - 1.5
mm, lo que hace que parezca un cocobacilo pleomórfico, que usualmente se tiñe
como Gramnegativo o Gram variable. Es un organismo anaerobio, presenta
hemolisis del tipo beta en agar sangre humana. Son cataliza y oxidasa negativo.
Esta bacteria se va a
poder aislar en agar, sangre incubado en anaerobiosis o en una atmósfera de 5%
de CO2 a 35°c por 48 horas.
Se originan colonias
translucida u opacas de 0.3 a 0.5 mm de diámetro, puntiforme, redondas, lisas,
con hemolisis tipo beta.
CONCLUSIÓN
Para hacer un frotis
debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Esperar hasta que el
líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el portaobjeto al aire
caliente de la llama del mechero.
La fijación se efectúa
para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan del
portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente. La
fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los
microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no
mueren todas las bacterias.
Fuentes consultadas:
· Gardnerella
vaginalis, consultado el día 10 de marzo del 2012, en
http://html.rincondelvago.com/gardnerella-vaginalis.html
No hay comentarios.:
Publicar un comentario