16 DE septiembre 2014
Tinción
de Gram
Bacterias Escherichia coli (Gram
negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.
Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).
Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra de líquido cerebroespinal.
Si hubiera una especie de bacteria Gram
negativa, apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.
Una tinción
Gram en la que observamos un mezclado deStaphylococcus
aureus (Coco Gram
positivo) y Escherichia coli (baciloGram negativo)
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo
de tinción diferencial empleado
en Bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas.
Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a
la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram
positiva a las
bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram
negativa a las que se
visualizan de color rosa o rojo o grosella
Metodología Recoger
muestras.
·
Hacer el extendido con un
palillo de madera.
·
Dejar secar a temperatura
ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
·
Fijar la muestra con metanol
durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
·
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las células gram
positivas se tiñen de color azul-púrpura.
·
Enjuagar con agua.
·
Enjuagar con agua.
·
Agregar alcohol acetona y esperar 30
segundos o 5 según la concentración del reactivo
(parte crítica de la coloración).
·
Enjuagar con agua.
·
Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y
esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram
negativas.
Para observar al microscopio
óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio),
los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan
de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa
con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se
agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el
complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner
de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste
las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas
permanecen violetas.
La safranina puede o no
utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de
contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del
protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se
verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por
ejemplo, safranina).
Esta
importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En
este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de
los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso
determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego
una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior;
después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal
tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada
diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos
microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con
facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se
califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloración y retienen
la segunda, de gram negativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos
clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los
representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal
o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al
compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de
color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula;
por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina
(violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc.,
se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices
rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos
metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el
método de Gram.
La facultad
de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia
viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos
que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera
coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de
micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni
constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá
por otras causas.
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre
daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la
importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una
posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:
El colorante
básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las
paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma
una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los
lípidos de la pared (más abundantes que en las células compositivas) se
disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de
cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es
indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las
teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn
(1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las
proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros,
esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus
grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en
soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que
la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido
proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al
combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en
medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el
“punto isoeléctrico”. Como los microorganismos contienen más de una proteína,
ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien
una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y
Stearn, los microorganismos gram positivos tienen una escala isoeléctrica de pH
inferior a la de los microorganismos gram negativos; y, a base de sus datos
experimentales, deducen las siguientes conclusiones:
·
Los microorganismos gram positivos
pueden hacerse gram negativos al aumentar la acidez.
·
Los microorganismos gram negativos
pueden hacerse gram positivos al aumentar la alcalinidad.
·
Los microorganismos de
reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gram negativos por
aumentar la alcalinidad.
·
Los microorganismos de reacción
positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gram negativos por aumentar la
acidez.
·
En la zona isoeléctrica
característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier
colorante.
·
Parece estar bien demostrado
que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil
combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
·
La materia grasa extraída de
los microorganismos gram positivos difiere de la obtenida de los
microorganismos gram negativos, en que la primera contiene una proporción mucho
mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes
oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram
son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un
carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los
colorantes básicos.
·
El cambio de respuesta a la
coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos
débilmente gram positivos cultivados en los medios que contengan sustancias
capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del
desarrollo.
Gianni
(1952) comprobó que los microorganismos gram positivos Bacillus subtilis y B.
anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a
tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia gram positiva debajo de la pared
celular, para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram
puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo
gram negativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción gram positiva
depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la
coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que
las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que
ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de
dicha pared. Por el contrario, los gérmenes gram positivos desintegrados
pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el
Gram.
La pared
celular de los microorganismos gram positivos y gram negativos es permeable al
violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y
colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales
obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad
del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar
la opinión de que la reacción gram positiva consiste esencialmente en la
formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo
y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los
microorganismos gram positivos, a diferencia de la de los gram negativos, sería
prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán
teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el
colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente
eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.
Ni los
grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el
mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la
permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del
complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del
disolvente al complejo constituido, son los principales factores que
intervienen en el mecanismo de esa coloración.
Los pasos que se han de seguir para realizar la tinción son los siguientes:
1º Fijamos la muestra mediante
calor.
2º Violeta cristal (Tiñe todas
las baterías, gram + y -) 1´.
3º Fijamos con Lugol, 1´.
4º Decoloremos con una mezcla
alcohol-cetona (los gram - se decoloren).
5º Safranina (colorante de
contraste, tiñe a los gram -), 1´.
Los tiempos para aplicar cada
colorante es orientativo. En la tinción se observarán de color azul-violeta las
gram + y de color rosa las gram -.
Bacterias resistentes a la
tinción Gram
Las siguientes bacterias de
naturaleza gram positiva, tiñen como gram negativas:
Utilidades
En el análisis de muestras
clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
·
Utilidad como control calidad
del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados
en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos
realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas
que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como
la atmósfera de incubación.
A partir de
la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma
esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos),
aparecer por pares (Diplococos), formar
cadenas (Estreptococos), o
agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos)
o en empalizada.
También pueden distinguirse
los espirales, que se clasifican en espirilos si son de
forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma",
o curvados, entonces se los designa vibrios.
Fundamentos de diferenciación
de Gram positivo y Gram negativo
Los fundamentos de la técnica
se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared
celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de
dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también
conocido como mureína)
Por el contrario,
la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra
unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la
interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano
unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha
de proteína, fosfolípido ylipopolisacárido.
Por lo
tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo
poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La
diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee
es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,
perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram
positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino
que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta.
Causas que alteran la tinción
de Gram
·
I: Edad de la bacteria.
·
II: Errores del operador.
·
III: Uso de antibióticos
A pesar de
la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células
(cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de
peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al
decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias
gram positivas se tiñan como gram negativas),Es por esta situación que junto a
la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).
Fuentes
Bibliografía
·
Aulton Michael E., Ciencia y
diseño de formas farmacéuticas, 2° edición, Ed. Elsevier España, 2004.
·
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·
Madigan, MT; Martinko J,
Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott
Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2.
·
Søgaard M, Nørgaard M,
Schønheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high
accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin
Microbiol 45: 1113.
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