MEDIOS DE CULTIVOS BACTERIANOS

INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.

Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.

En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser

preparados en forma líquida o en forma sólida.

Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: 

• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal,

las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos
no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Trabajo Práctico Nº 6
PREPARACIÓN DE
MEDIOS DE CULTIVO
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• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.
De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:
• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
• Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar
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fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).
Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.
OBJETIVO
Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de:
Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de medios de cultivo deshidratados.
Indicar el método de esterilización apropiado.
FUNDAMENTO
La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos
en el laboratorio.
PROCEDIMIENTO
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.
2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes.
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Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.
3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.
4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C).
Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la solución correspondiente pero 1 N.
5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor.
6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución y fecha de preparación.
7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones señaladas en el trabajo práctico N° 8.
Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.

RESULTADOS
MEDIO DE CULTIVO: ____________________________________
CANTIDAD PREPARADA: _________________________________
CANTIDAD PESADA:
CÁLCULOS
pH inicial: _______________ pH final: ________________
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ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO:
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ESTADO FÍSICO:
􀀀 Sólido 􀀀 Líquido
TIPO DE MEDIO DE CULTIVO
• Según la naturaleza de los ingredientes:
* Natural o complejo 􀀀 Sintético
• Según el propósito de uso
􀀀 Enriquecimiento 􀀀 Selectivo 􀀀 Diferencial 􀀀 Otro
DISTRIBUCIÓN: __________________________________________________
CONDICIONES DE ESTERILIZACIÓN: _________________________________
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: _______________________________

BIBLIOGRAFÍA
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales
(2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
Merck. 2002. Microbiology Manual

Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología
Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A. México D.F.

Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa. Prof. Alessandra Garcés Octubre 2001. Prof. Katiuska Saravia
Revisión

TÉCNICA PARA LA TINCIÓN DE GRAM

16 DE septiembre 2014

Tinción de Gram

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra de líquido cerebroespinal. Si hubiera una especie de bacteria Gram negativa, apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

Una tinción Gram en la que observamos un mezclado deStaphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (baciloGram negativo)

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

Metodología             Recoger muestras.

·         Hacer el extendido con un palillo de madera.

·         Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.

·         Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)

·         Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las células gram positivas se tiñen de color azul-púrpura.

·         Enjuagar con agua.

·         Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.

·         Enjuagar con agua.

·         Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos o 5 según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración).

·         Enjuagar con agua.

·         Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Explicación[editar]

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I₂ (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I₂/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.

Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gram negativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.

El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram.

La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.

Teorías[editar]

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células compositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y Stearn, los microorganismos gram positivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gram negativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

·         Los microorganismos gram positivos pueden hacerse gram negativos al aumentar la acidez.

·         Los microorganismos gram negativos pueden hacerse gram positivos al aumentar la alcalinidad.

·         Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gram negativos por aumentar la alcalinidad.

·         Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gram negativos por aumentar la acidez.

·         En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.

·         Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.

·         La materia grasa extraída de los microorganismos gram positivos difiere de la obtenida de los microorganismos gram negativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.

·         El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente gram positivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprobó que los microorganismos gram positivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia gram positiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gram negativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción gram positiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes gram positivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.

La pared celular de los microorganismos gram positivos y gram negativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción gram positiva consiste esencialmente en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos gram positivos, a diferencia de la de los gram negativos, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.

Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.

Los pasos que se han de seguir para realizar la tinción son los siguientes:

1º Fijamos la muestra mediante calor.

2º Violeta cristal (Tiñe todas las baterías, gram + y -) 1´.

3º Fijamos con Lugol, 1´.

4º Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona (los gram - se decoloren).

5º Safranina (colorante de contraste, tiñe a los gram -), 1´.

Los tiempos para aplicar cada colorante es orientativo. En la tinción se observarán de color azul-violeta las gram + y de color rosa las gram -.

Bacterias resistentes a la tinción Gram

Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva, tiñen como gram negativas:

·         Mycobacterias (están encapsuladas).

·         Mycoplasmas (no tienen pared).

·         Formas L (pérdida ocasional de la pared).

·         Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).

Utilidades

En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

·         Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

·         Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación.

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.

También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido ylipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta.

Causas que alteran la tinción de Gram

·         I: Edad de la bacteria.

·         II: Errores del operador.

·         III: Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas),Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).

Fuentes

Bibliografía

·         Aulton Michael E., Ciencia y diseño de formas farmacéuticas, 2° edición, Ed. Elsevier España, 2004.

·         Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7.

·         Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2.

·         Søgaard M, Nørgaard M, Schønheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.