¿COMO SE REALIZA EL
CONTEO DE CÉLULAS EN LA CÁMARA DE NEUBAUER?
La cámara de Neubauer está construida en un bloque
grueso de cristal con forma rectangular (como un portaobjetos). Cuatro surcos
transversales tallados en el cristal delimitan cinco zonas. Además la zona
central está dividida por un pequeño surco perpendicular a los anteriores.
Las dos zonas externas sirven para sujetar la cámara a
la platina del microscopio. Las dos zonas rectangulares angostas están
delimitadas por bloques 0,1 mm más altos que la base del bloque, lo cual
permite colocar un cubrecámara para delimitar el volumen en el que se realizará
el recuento celular.
Finalmente los dos sectores centrales configuran la
región verdaderamente útil, donde están grabados dos retículos cuadrangulares
de 3 mm de lado.
Cada retículo consta de 9 cuadrados grandes, cada uno
de 1 mm de lado y por ende de 1 mm2 de superficie. Esto hace que, con el
cubrecámara colocado, cada cuadrado grande represente un volumen de 0,1 mm3 lo
cual equivale a 0,1 ul (10-4 ml).
Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas están divididos en 16
cuadrados medianos. En ellos debe realizarse el recuento de leucocitos, debido
al tamaño que presentan estas células.
El cuadrado grande central puede tener dos aspectos. En la Cámara de Neubauer tradicional, está dividido en 16 cuadrados medianos y cada uno de ellos se halla dividido a su vez en 25 cuadrados pequeños (400 cuadrados pequeños en total). Además la última fila y la última columna de cuadrados pequeños está dividida al medio.
El cuadrado grande central puede tener dos aspectos. En la Cámara de Neubauer tradicional, está dividido en 16 cuadrados medianos y cada uno de ellos se halla dividido a su vez en 25 cuadrados pequeños (400 cuadrados pequeños en total). Además la última fila y la última columna de cuadrados pequeños está dividida al medio.
En cambio, en la cámara de Neubauer modificada el
cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos y cada uno de
ellos está dividido en 16 cuadrados pequeños (400 cuadrados pequeños en total).
Cualquiera sea la cámara empleada, este cuadrado grande central es el empleado
en el recuento eritrocitario y plaquetario.
Para realizar el recuento celular, debe colocarse el
cubreobjetos sobre el portaobjetos de esta cámara e introducir entre ambos la
muestra celular previamente preparada. Debe evitarse que la muestra rebalse,
porque si esto sucede las células a contar también se perderán. La velocidad de
llenado de la cámara debe ser homogénea, evitando así una mala distribución de
las células en el preparado que traerá aparejado errores en el recuento.
La muestra no debe secarse, por lo tanto es
recomendable guardar la cámara de Neubauer cargada dentro de una cámara húmeda
para que sedimenten las células. Luego se coloca la cámara en un microscopio
óptico y se procede al conteo, eligiendo para ello los cuadrados apropiados. Se
debe elegir un criterio para definir qué células se cuentan y cuáles no, cuando
las mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado.
Una vez contadas las células se calcula la
concentración en la muestra original, considerando: la dilución de la muestra
hecha para el sembrado, la cantidad de cuadrados considerados, el número de
células contadas y el volumen de muestra debajo de cada cuadrado.
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de
partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario
determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje
de éstas que son viables.
Para
determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la
relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas
variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos
de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.
El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios
en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora
en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. Como se puede
ver en el esquema, una pequeña abertura entre los electrodos es la zona
sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en
suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio
volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de
voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula.
controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es
posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir
varios miles de partículas por segundo, independientemente de su forma, color y
densidad.
En la unidad de Citometría de flujo y Microscopia Confocal de los Servicios Científico-Técnicos de la Universidad de Barcelona se dispone de contadores celulares.
Sin embargo, es posible
determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con
una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio.
Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra
de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan
un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de
partículas presentes en ese volumen se puede determinar. la densidad de partículas en la suspensión de origen.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio
de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3
mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el
área sombreada y marcada L corresponde a 1
milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste
dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1
microlitro.
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x
células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será
:
concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas
como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños
cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un
microscopio invertido de contraste de fases.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El
más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se
introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana.
Así pues las células que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son
consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a células
viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las
células en la suspensión, determinando como inviables sólo aquellas con la
membrana rota. Existen otros métodos de
determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.
- se
aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con algodón. Se
coge entre el pulgar y el índice y se hace una punción rápida y penetrante
a través de la piel de la punta del dedo con una lanceta estéril.
- Se deshecha la
primera gota de sangre y se aspira la siguiente con la pipeta de dilución
perfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede
utilizarse la pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la
entrada de burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para
conseguir el enrasado.
- A continuación se toma con la
pipeta líquido de Hayem, isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así,
la sangre queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o al
1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen de la bola de la
pipeta es 100 veces superior al del capilar de la misma. (Si hemos
utilizado la pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml
de líquido de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).
- Tomamos la
pipeta (o el tubo de ensayo) entre los dedos índice y pulgar y agitamos. A
través de la goma de conexión con la pipeta, soplamos para despreciar las
primeras gotas por corresponder al líquido que estaba en el capilar.
5. Se adapta
un cubreobjetos sobre una cámara cuentaglóbulos limpia y seca y se coloca una
gota en uno de los lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena
el retículo de la misma.
6. Una vez
preparada la cámara se coloca sobre la platina del microscopio dejándose unos
minutos en reposo para que sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador
bajo y luz débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y luego se
cambia al fuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a cabo en los
cuadrados pequeños del retículo marcado en color rojo. Finalizado el recuento
se procede a la limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada y
alcohol-éter sucesivamente.
7
.El volumen de sangre en el cual se han
contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el
factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados
contados.
Consulta pagina www; Uriel-93.ober-blog.com y en este mismo sitio
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